论文已发表在《发酵科技通讯》2022年4期
论单通道检测在发酵尾气分析中的应用
公维丽1,2,刘仲汇1,2,马耀宏1,2,史建国1,2
(1.齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物研究所,山东 济南 250014;
2.山东省生物传感器重点实验室,山东 济南 250014)
摘要:发酵尾气分析技术在业内的应用已逐渐展开,但人们对单通道检测的认识依旧模糊 。从尾气分析的意义、生物过程的“实时性”以及发酵过程的“临界点”反映发酵状态的改变等方面,阐述了发 酵尾气分析应采用实时、连续、在线检测;通过以尾气分析获得的“临界点”在发酵工程中的应用(指 导转速调整、流加补料、乳糖诱导及处理异常发酵),进一步阐明只有单通道检测才能真正做到检测 的实时、连续、在线,捕捉到有价值的“临界点”信息。
关键词:发酵;尾气分析;单通道;检测
中图分类号:Q819 文献标志码:A 文章编号:1674-2214(2022)04-0217-05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas analysis
GONG Weili1,2, LIU Zhonghui1,2, MA Yaohong1,2, SHI Jianguo1,2
(1.Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Biology Institute,Jinan 250014, China;
2.Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors,Jinan 250014, China)
Abstract: The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry, but single-channel detection is still poorly understood. In this paper, we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real-time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis, the “real-time”of biological process, and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state, and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment, flow feeding, lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real-time, continuous and online detection, and capture valuable “critical point”information.
Keywords: fermentation; tail gas analysis; single channel; detection
收稿日期:2022-09-01
基金项目:齐鲁工业大学科教产融合试点工程基础研究类基金资助项目 (2022PY067);齐鲁工业大学科教产重大创新专项(2022JBZ01-06); 山东省重点研发计划项目 (重大关键技术)(2016ZDJS07A20)
作者简介:公维丽(1988 — ),女,山东临沂人,副 研 究 员,研究方向为生物传感器技术 、微生物发酵工程,E-mail:15264110812@163.com。
通信作者:刘仲汇高级工程师,E-mail:sws2605384@163.com。
发酵尾气分析指在发酵过程中在线检测尾气中 的 CO2 和 O2 的体 积 分 数,计 算 呼 吸 代 谢 参 数 CO2 释放率(Carbon dioxide evolution rate,CER)、摄 氧 率(Oxygen uptake rate,OUR) 和 呼 吸 商 (Respira- tory quotient,RQ),得到细胞代谢信息,是发酵工程 的一种过程分析技术(Process analysis technology, PAT)。 无论 是 在 微 生 物 生 长 阶 段,还 是 在 产 物 合成阶段,CER 的变化都与菌 体 生 长 状 态 、碳 源 的 消耗和供氧情 况 密 切 相 关 。 OUR 虽然取决于菌体浓度,但是也与发酵 液 的 营 养 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 体 的比生长 速 率 以 及 碳 源 的 种 类 和 浓 度 等 因 素 有 关 。RQ的变化反 映 了 微 生 物 胞 内 代 谢 的 变 化,揭 示 了发酵过程中微观代谢途径通量的变化,是 微 生 物 菌体生长 、能量代谢维持 、产物和副产物合成代谢共同作用的结果[1-7] 。利用这些参数及相关性分 析,可 以 更好地对发酵过程进行监测 、分析,从而深入了解发 酵规律,优化发酵 工 艺,控 制 发 酵 过 程,提 高 发 酵 产 率和产量,降低成本,加快新品研发和产业化 。
与溶解氧和 pH 检 测 相 比,尾 气 分 析 得 到 的 参 数 CER,OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了发酵过 程的部分特质,揭示了微生物的生理特性,具有生物 学意义 。尾气分析时仅采集 发酵罐排出的尾气,不 影响发酵罐 结 构,不 接 触 发 酵 液,无 染 菌 风 险[8-10], 更容易被业界接受,故成为现代发酵工程的重要分析 手段,已被应用于发酵、制药、生化、农业、环保和食品 等领域 。 虽然该技术已在业内得到应用,但是由于历 史原因以及设备成本等因素的影响,对检测设备是否 需要采用独立的单 通 道,认 识 依 旧 模 糊 。 因 此,笔 者 从理论与实际应用两方面对该问题加以分析探讨 。
1 发酵尾气分析应实时连续在线
在 发 酵 过 程 中,微 生 物 生 长 一 般 需 要 经 历 迟 缓 期 、对数生 长 期 、稳 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 规 的 液 态 好氧分批发酵周期一般为数小时至数天 。在看似较 长的发酵过程中,发酵状态的转变 往往发生在很短 的时间内,某些代谢变化可能用时更短 。
张嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 过 程 优 化》[12] 及 相 关论 文[13] 中 详细阐述了生 物 过 程 的 “实 时 性 ”: 1) 从生物 过程发生的时 间以及 生物技术发展特点 来看,对于以活细 胞为主体的细胞 大规模培养的生 物反应过程,可粗分为在以基因水平的分子尺度 、代 谢调节的细胞尺度和工艺控制的反应器尺度上发生 的;2) 可将微 生 物 和 细 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制,亚基的结合和解离以及共价修饰和降 解) 控制的时间常数描述在毫秒至秒的范围内,在基 因表达调控水平上(诱 导 、转 录的阻遏和去阻遏) 描 述至分钟 。考察微 生 物 和 细 胞 代 谢 调 节,在 以 秒 为 单位的时间尺 度 上 是 合 适 的 。 因 此,作 为 动 态 观 测 记录细胞代谢状况 的 发 酵 尾 气 分 析 设 备,应 对 排 出 的尾气进行实时连续在线检测,只有这样,才能准确 捕捉到发酵过程中代谢的改变 。
2 合理利用发酵过程中的临界点
2.1 发酵过程中的临界点
李强等[14] 在《微生物发酵 中 二 氧 化 碳 释 放 速 率 变化规律》中,通过青霉素 、古龙酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 个体系的发酵实验及动力学分析,对 CER 的变化规律进行了探 究,研 究 结 果 表 明:无 论 是 霉 菌 、酵 母菌 、细 菌 、单 液 相 体 系 、双 液 相 体 系,还 是 纯 种 发 酵 、混合菌发 酵,CER 的 变 化 都 与 体 系 状 态 变 化 有 着密切联系;CER 曲线上的转 折 点 对 应 的 就 是 发 酵 状态的转变点 。 由该文献的 CER 曲线可以发现:在 这些转折点处曲线发生了方向性改变,即 由 升 转 为 降,或者由降转为 升,曲线出现明显的峰或谷,发 酵 体系的状态都发生了显著改变 。
在发酵过程中还存在另一类极具价值 的 变 化 点,即发酵体系的状态变化由缓慢到快速,或由快速 转为缓慢的时间点,比如在微生物生长由迟缓期进 入对数生长期,由 对数生长期进入稳定期以及由稳 定期进入衰亡期的那些时间点上,都有可能出现该 情况 。在这类时间点上,虽然发酵体系的 CER 曲线 没有发生方向性改 变(由 升到降或由降到升),但 是 发生了变化速率的 显 著 改 变,或者说发生了从一个 发酵阶段转变到另一个发酵阶段 。这类变化点在发 酵过程中普遍存在,不仅有着明确的生物学意义,而 且具有非常重要的应用价值 。可将发酵过程中这类 变化速率显著改变 的 点,以及发生方向性改变的转 折点统称为临界变化点,简称“临界点”,其特征是发 酵体系发生了从一个状态到另一个状态的改变,亦 或从一个阶段到另一个阶段的改变 。
应用发酵尾气分析技术进行实时连续 在 线 监 测,可方便 、直观地获得发酵过程中的临界点 。这些 临界点提供的丰富信息可以帮助人们辨识发酵过程 状态,为 调 整 搅 拌 转 速/通 气 量 、流 加 补 料 、基 因 诱 导,以及异常 发酵处理等一系 列 工艺操 作提供 明确 指导,同时也为工艺放大提供对比数据 。充分重视和 利用这些临界点信息对优化发酵工艺具有重要意义 。
2.2 利用发酵过程临界点指导操作
2.2.1 利用临界点调整供氧
溶解氧是好氧发酵微生物生长及产物合成所必 需的 。在发酵过程 中,特 别是在高密度工程菌培养 中,溶解氧往往 成 为 限 制 性 因 素 。 如何适时调整搅 拌转速和通气量以达到***适溶解氧,是 发 酵 工 艺 的 关键点之一[15-17] 。 一般根据溶解 氧 DO、pH 及 镜 检 结果等进行调整,比较粗放,而利用尾气分析曲线的 临界点,则可以准确把握调整时机 。
在山东省科学 院 生 物 研 究 所 承 担 的“植 酸 酶 工 程菌高密度发酵智能控制关键技术”(山东省重点研 发计划项目 2016ZDJS07A20) 项 目 中,在 10L 实 验 室发酵罐上,采用 FGA 发 酵 尾 气 分 析 仪,对 重 组 毕 赤酵母表达植酸酶过程进行实时在线检测 。 发酵温 度 30 ℃,初 始 发 酵 液 体 积 7L,通 气 量 5L/min,搅拌转速 200r/min 。 发酵 6h5min 时,CER 开 始 缓 慢上升;发 酵 25h26 min 时,CER 出 现 快 速 上 升, 曲线上形成明显的 临 界 点,预示发 酵进入对数生长 期,此时 立刻调整搅拌转速至 400r/min;之 后 随 着 CER 的上升,阶段性小步调整搅拌转速达 530r/min, 并保持至 发 酵 48h30 min,之 后调整搅拌转速至 500r/min,直至 发 酵 结 束 。 该 发 酵 过 程 的 CER 变 化曲线如图 1 所示 。在该过程中,发 酵 15h 时 进 行 甲醇诱导,诱 导 5h 后 开 启 蛋 白 表 达,SDS-PAGE 检 测植酸酶表达见文献[18],***终酶活达 3 000U/mL。
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